Bead-based protein arrays using protein tag-specific nanobodies

　　使用蛋白標簽特異性nanobodies進(jìn)行基于珠子的蛋白分析

　　Figure 1 Workflow to generate bead-based protein arrays (BPAs) using tag-specific nanobodies and the application of such BPAs to study protein-protein interactions (PPIs). GFP- or GST-tagged bait-proteins are derived from small-scale expression cultures of bacterial or mammalian cells. Upon incubation of the crude lysates with color-coded beads (CCBs) comprising tag-specific nanobodies, bait-proteins are one-step purified and site-directed immobilized onto individual CCB populations, thereby generating BPAs. In the next step, cell lysates comprising the proteins’ interaction candidates to be analyzed (prey-proteins) are incubated with the BPAs. Finally, levels of prey-protein bound to the individual bait-proteins are quantified using tag- or gene-specific antibodies in a bead array reader.

　　背景

　　關(guān)于動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPIs)的知識對于了解細胞過(guò)程和對這些相互作用的化合物的發(fā)現和驗證是至關(guān)重要的。Bead-based protein assays(BPAs)是分析bait-蛋白質(zhì)和prey-蛋白質(zhì)之間的相互作用的新興方法。然而，大多數研究仍采用細菌衍生的bait-蛋白質(zhì)，由于它們缺乏轉錄后的修飾，或者在外源表達中不能正確折疊而有使用上的限制。

　　本應用筆記提出了一個(gè)新穎的方法來(lái)生成BPAs去結合與固定矩陣基質(zhì)結合的微米級純化的bait-蛋白質(zhì)。在細菌或哺乳動(dòng)物細胞內，bait-蛋白質(zhì)與GST-或GFP-融合結構被生產(chǎn)出，并能使用ChromoTek高親和力的特殊標簽標記蛋白的nanobodies：GFP-Trap®或GST-Trap偶聯(lián)的彩色珠子，一步純化及固定溶菌產(chǎn)物。zui后，將這些bait-偶聯(lián)的珠子結合在蛋白陣列中，用于小型多重GST -和GFP pulldown實(shí)驗。zui近這項技術(shù)被成功地應用于研究蛋白酶體抑制或信號通路擾動(dòng)后內源性prey-蛋白質(zhì)β-catenin與一系列*的bait-蛋白質(zhì)相互作用的動(dòng)態(tài)變化(Groll N., et al., 2015) 。

　　結果

　　從細菌或細胞裂解物中，將GST-和GFP-標記的bait-蛋白固定在珠子上，生成一個(gè)基于bead的蛋白陣列(BPA)

　　運用原理論證研究測試概述的方法來(lái)分析蛋白酶體抑制或信號通路擾動(dòng)后內源性β-catenin 與一系列*的bait-蛋白質(zhì)的相互作用。為了生成基于珠子的蛋白陣列(BPAs)，建立了一個(gè)兩步法生成*的bait-蛋白質(zhì)的方法。首先GST-或GFP-特異性nanobodies共價(jià)偶聯(lián)上彩色編碼珠子(CCBs)。隨后，這些CCBs與油溶性的細菌或細胞裂解產(chǎn)物孵育，包括β-catenin特異性bait-蛋白質(zhì)ICAT, ECT 和TCF4或者是GST-或GFP-融合結構，相應的bait-蛋白質(zhì)固定在nanobody包被的CCBs上。CCBs的檢測飽和度為50 µg/ml的總蛋白濃度。因此，BPA生產(chǎn)的標準條件是100 µl 1 mg/ml的油溶性蛋白提取物與大約200000珠子偶聯(lián)。顯然，檢測表明不同的CCB集群不發(fā)生蛋白轉移，這說(shuō)明了在一段時(shí)間內，不同的珠子集群上的bait-蛋白質(zhì)是沒(méi)有交換的。

　　蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析

　　為了確定和比較固定后bait-蛋白質(zhì)的功能，我們應用BPAs目標多遠分析來(lái)檢測復合實(shí)驗中綁定的β-catenin的動(dòng)態(tài)變化。β-catenin是標準Wnt通路的關(guān)鍵效應分子。β-catenin在細胞中的濃度受細胞質(zhì)破壞復合體嚴格控制(Liu C, et al., 2002)。由于Wnt受體的外在活性，破壞復合體功能被滅活(Huang H, et al., 2008)，導致細胞質(zhì)內hypo-磷酸化β-catenin的積累，以及轉位進(jìn)入細胞核中，在細胞核中它與淋巴增強因子/T細胞因子(LEF/TCF)家族相互作用，從而激活Wnt應答基因的轉錄(Moismann C., et al., 2009) 。除了作為轉錄因子，β-catenin還作為細胞膜與細胞骨架間的受體分子，與細胞黏附蛋白家族鈣粘蛋白,α-catenin和肌動(dòng)蛋白形成蛋白復合體。

　　在我們的研究中，我們通過(guò)針對β-catenin的穩定性調節了標準Wnt通路的活性。因此，我們使用MG132抑制了β-catenin蛋白酶體降解。另外我們使用了GSK3β的特異性抗體CHIR-99021 (CHIR)來(lái)阻斷β-catenin的磷酸化及泛素化，從而模擬Wnt通路的狀態(tài)(Bennett CN, et al., 2002)。如前所述，我們使用BPAs來(lái)監測內源性β-catenin結合性的動(dòng)態(tài)變化，從而選擇復合實(shí)驗的bait-蛋白質(zhì)。因此，用分離自處理或未處理過(guò)的HEK293T的 20µg 蛋白提取物與BPAs一起孵育。用MG132和CHIR同時(shí)處理，會(huì )導致強烈的可測量的內源性β- catenin與三種bait-蛋白質(zhì)：ICAT, ECT和TCF4的相互作用(Fig.2)。然而，這兩種抑制劑的影響很小，有限數量的β-catenin能被這三種bait-蛋白質(zhì)捕獲而顯示顯著(zhù)差異(Fig.2)。

　　Figure 2 Multiplex analysis of β-catenin binding profiles to different bait-proteins upon GSK3β or proteasome inhibition. BPAs comprising the GFP- or GST labeled bait-proteins ICAT (A & D), ECT (B & E) and TCF4 (C & F) were incubated with soluble protein fractions derived from HEK293T cells. To modulate the levels of endogenous β-catenin, HEK293T cells were either left untreated (blank), or incubated with 10 µM MG132 (proteasome inhibitor), or DMSO as a control (A, B and C) or treated with 10 µM CHIR (GSK3β-inhibitor) and H2O as a control (D, E, and F). Bound levels of β-catenin were detected using a monoclonal anti-β-catenin antibody. Shown are mean fluorescence intensities (MFI) and standard deviations of three independent biological experiments. Statistical significance was evaluated with the students t-test (*p≤0.05; **p≤0.01;***p≤0.001).

　　ICAT作為bait-蛋白時(shí)，細胞β-catenin水平的明顯增加，而ECT和TCF4作為bait-蛋白時(shí)程度較小。值得注意的是,分離自?xún)蓚€(gè)不同的表達系統的標記蛋白的使用，造成了內源性β-catenin結合水平的顯著(zhù)差異。由于bait-蛋白ECT和TCF4存在，GFP-versions比GST-tagged能夠結合更多的β-catenin。我們的研究結果表明，與相應的GST-fusions相比，GFP-ECT處理后β-catenin信號高出50倍，GFP-TCF4處理后β-catenin信號高出4倍。這表明，當這些bait-蛋白表達并與哺乳動(dòng)物溶菌產(chǎn)物結合后，它們的功能會(huì )提升。

　　結論

　　高親和性特異性標記的nanobodies的應用，能直接從真核生物和原核蛋白表達培養物中產(chǎn)生一種、快速、可再生的基于珠子的蛋白陣列(BPAs)。我們通過(guò)分析信號蛋白β-catenin與三種相互作用物的結合表現，展示了真核表達系統的優(yōu)勢。我們認為這種方法適用于研究細胞通路中蛋白質(zhì)上的小分子的作用，并通過(guò)BPAs為媒介擴展到高通量模式。新的高親和性標記nanobodies對于額外蛋白質(zhì)或標簽肽的特異性識別，將大大增加這種方法的使用機會(huì )。

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