PCR儀的反應過(guò)程中dNTP和Mg2+充當的什么樣的角色呢？

　　脫氧核苷酸是DNA的基本組成元件，為DNA合成所必需。PCR中使用脫氧核苷酸通常是4種脫氧核苷酸的等摩爾混合物，即dATP（腺嘌呤脫氧核糖核苷三磷酸）、dGTP（鳥(niǎo)嘌呤脫氧核糖核苷三磷酸）、dCTP（胞嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸）和dTTP（胸腺嘧啶脫氧核糖核苷三磷酸），通常統稱(chēng)為dNTP。

　　PCR擴增效率和dNTP的質(zhì)量與濃度有密切關(guān)系，dNTP干粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應配成高濃度，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液為宜，pH調節到7.0-7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì )使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP的濃度應為50-200μmol/L，尤其注意4種dNTP的濃度要相等（等物質(zhì)的量配制），如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì )增加錯配概率。dNTP濃度過(guò)低又會(huì )降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

　　反應體系中游離Mg2+的濃度對PCR反應中耐熱DNA聚合酶的活性、PCR擴增的特異性和PCR產(chǎn)物量有顯著(zhù)的影響。反應體系中Mg2+濃度低時(shí)，會(huì )降低Taq DNA聚合酶的催化活性，得不到足夠的PCR反應產(chǎn)物；過(guò)高時(shí)，非特異性擴增增強。此外，Mg2+濃度還影響引物的退火、模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度、產(chǎn)物的特異性、引物二聚體的生成等。在標準的PCR反應中，Mg2+的適宜濃度為1.5-2.0mmol/L。值得注意的是，由于PCR反應體系中的DNA模板、引物和dNTP磷酸基團均可與Mg2+結合從而降低游離Mg2+的實(shí)際濃度，因此，Mg2+的總量應比dNTP的濃度高0.2-2.5mmol/L。如果可能的話(huà)，制備DNA模板時(shí)盡量不要引入大劑量的螯合劑（即EDTA）或負離子，因為它們會(huì )影響Mg2+的濃度。